PCR adalah Penemuan Besar dalam Sejarah Umat Manusia

Seiring berjalannya waktu dan semakin majunya zaman, teknologi PCR turut mengalami inovasi, terutama untuk menjawab berbagai kebutuhan di bidang riset atau diagnostic. Inovasi yang dilakukan pada teknologi PCR adalah komponen “software” yaitu enzim maupun komponen kimia pendukungnya, komponen “technique” yaitu metodologi PCR, serta komponen “hardware” yaitu mesin yang digunakan untuk PCR itu sendiri.

Bahkan, penggunaan PCR yang semula hanya untuk perbanyakaan DNA, saat ini sudah jauh berkembang. Contohnya pada bidang kedokteran, di mana dengan PCR dapat memprekdisi suatu penyakti atau mengukur efektivitas obat dengan perhitungan jumlah salinan gen, analisa keragaman gen pembawa penyakit bahkan dari analisa mutasi gen.

Dengan perkembangan zaman, inovasi pada mesin PCR adalah hal yang lumrah. Setidaknya saat ini sudah ada empat jenis mesin PCR yang dikembangkan dan digunakan pada penelitian serta diagnostic. Beberapa jenis mesin PCR adalah:

1. Mesin PCR Konvensional Biasa

Merupakan jenis mesin PCR yang tidak banyak memiliki fitur dan bisa dikatakan mesin yang paling sederhana dalam penggunaannya. Tentu, jika dibandingkan dengan mesin PCR lainnya, mesin jenis ini sudah sangat ketinggalan zaman. Tapi, memang mesin ini masih banyak digunakan di beberapa belahan dunia.

2. Mesin PCR Konvensional dengan Gradient Temperature

Pada jenis mesin PCR yang dilengkapi dengan gradient temperature, terdapat fungsi utama yaitu untuk optimasi suhu annealing primer secara paralel pada pemakainya. Tujuannya untuk mendapatkan suhu annealing terbaik yang akan digunakan pada proses menyalin DNA selanjutnya.

Pengguna mesin ini cukup memilih suhu annealing yang diingikan sesuai dengan acuan nilai Tm (Melting Temperature) primer dikurangi 5 derajat Celsius .

3. Real-Time PCR

Sedangkan pada mesin Real-Time PCR sudah menggunakan teknologi komputerisasi. Fitur di dalam mesin ini sudah sangat lengkap, termasuk program gradient temperature. Real Time PCR punya keunggulan dalam beberapa hal, antara lain:

- Perbanyakan DNA selama proses PCR dapat diamati secara langsung (Real-Time).

- Mampu menghitung secara tepat jumlah DNA yang diperbanyak pada tiap siklusnya dan memungkinkan material genetika yang terdapat pada sampel bisa lebih tepat dihitung.

- Tersedia beragam jenis deteksi seperti mutasi, genotyping, perhitungan jumlah sel dan ekspresi gendan.

- Eliminasi keharusan analisa lebih lanjut seperti elektroforesis yang jadi keterbatasan pada mesin PCR konvesional.

4. Droplet Digital PCR

Mesin PCR ini merupakan teknologi paling maju dari mesin PCR. Droplet digital PCR dikembangkan oleh perusahaan bernama Bio-Rad Ltd. Alih-alih proses amplifikasi DNA dilakukan pada sistem aquoes, dengan mesin droplet digital PCR proses sintesis DNA dilakukan secara enkapsulasi air yang teremulsi dalam minyak.

Metode ini menyebabkan perhitungan atau analisa DNA menggunakan droplet digital PCR didapatkan hasil yang lebih akurat. Mesin PCR ini juga memberi dampak bagi penelitian maupun diagnostik seperti:

- Deteksi mutasi DNA yang langka.

- Analisa keragaman jumlah salinan DNA.

- Ekspresi gen dan analisa microRNA.

- Aplikasi dalam Next Generation Sequencing (NGS)

- Analisa aktivitas enzim dengan resolusi skala sel tunggal (single cell).

Kunci dari pelaksanaan reaksi PCR adalah tersedianya Taq Polymerase, Primer, DNA template dan nukleotida (blok pembangun DNA). Seluruh bahan tersebut dicampur ke dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim. Kemudian, bahan tersebut melewati siklus pemanasan dan pendinginan berulang yang menyebabkan amplifikasi DNA.

Berikut ketiga tahapnya:

1. Denaturation / denaturasi (96°C)

Pada proses denaturasi, panas memengaruhi strand DNA dan akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).

2. Annealing / penempelan (55-65°C)

Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel kemudian berikatan pada daerah komplementer di sekuen single-stranded DNA.

3. Extension / elongasi (72°C)

Ketika ada di suhu ini, Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru.

Siklus di atas bisa saja dilakukan berulang hinga 25-35 kali, serta dibutuhkan waktu sekitar 2-4 jam tergantung dari Panjang DNA yang ingin disalin. Apabila reaksinya efisien, wilayah target bisa berubah dari satu atau beberapa salinan jadi milyaran.

Sebabnya, ada banyak salinan atau untai ganda primer serta banyak molekul Taq polymerase yang mengambang di sekitar reaksi. Hal tersebut membuat jumlah molekul DNA kira-kira akan berlipat ganda dalam setiap putaran siklus.

Hasil reaksi PCR bisa dilihat dengan Gel Electrophoresis. Penggunaan gel ini memanfaatkan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen DNA yang ada di dalam matriks gel berarus listrik, sehingga fragmen DNA terpisah berdasar ukurannya.

Sebagai tolak ukur, digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment DNA hasil PCR. Fragmen DNA yang memiiki panjang sama akan membentuk ‘pita’ pada gel, dan akan terlihat dengan mata jika gel diwarnai dengan pewarna pengikat DNA.

Tapi, teknologi PCR pasti akan terus mengalami inovasi seiring perkembangan ilmu pengetahuan. Yang perlu untuk diingat, tiga komponen utama dalam inovasi teknologi PCR adalah software, hardware, serta technique.